賽默飛 QuantStudio 5 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程

一、目的

為確保賽默飛 QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的正確使用，提高實(shí)驗(yàn)效率，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，特制定本操作規(guī)程。該規(guī)程適用于分子生物學(xué)、基因表達(dá)分析、核酸檢測等相關(guān)實(shí)驗(yàn)中的PCR檢測工作。

二、適用范圍

本規(guī)程適用于使用賽默飛 QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增和熒光定量檢測的實(shí)驗(yàn)操作人員。適用場景包括科研實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)療檢測機(jī)構(gòu)、食品和環(huán)境檢測單位等。

三、儀器簡介

QuantStudio 5 是賽默飛生命科學(xué)儀器平臺推出的一款實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)備，具備96孔與384孔兩種格式版本。該儀器配置靈敏的熒光檢測系統(tǒng)和高精度溫控模塊，配套Design and Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和可視化分析，支持多種應(yīng)用場景。

主要技術(shù)參數(shù)：

• 檢測通道：最多支持6個(gè)熒光通道

• 熒光染料兼容性：FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等

• 樣品通量：96孔（0.2 mL）或384孔板

• 溫控精度：±0.25℃

• 升降溫速率：最大4.0℃/秒

• 最小檢測體積：10 μL（推薦），5 μL為限

• 光學(xué)系統(tǒng)：獨(dú)立激發(fā)和發(fā)射濾光片，快速濾片切換

• 軟件平臺：QuantStudio Design and Analysis 軟件

• 數(shù)據(jù)輸出格式：Excel、PDF、CSV等

四、使用準(zhǔn)備

1. 儀器開機(jī)檢查

• 打開主機(jī)電源，檢查設(shè)備狀態(tài)燈是否正常（綠色為正常）

• 確保計(jì)算機(jī)與主機(jī)通過USB或局域網(wǎng)連接

• 啟動(dòng)QuantStudio軟件，登錄用戶賬戶

• 檢查樣品艙是否干凈，無液體殘留或雜質(zhì)

• 確保熒光濾光片和溫控板無損傷、無污染

2. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備反應(yīng)體系，包括引物、探針、酶、緩沖液及模板核酸

• 樣本混勻后加樣至PCR板或試管中，封板并輕輕離心去除氣泡

• 樣本總量建議控制在10–20 μL，確保PCR反應(yīng)效率

• 使用推薦的光學(xué)透明封板膜，避免熒光信號干擾

3. 模板與耗材管理

• 使用專用PCR板（0.2 mL）和光學(xué)封板膜

• 樣本添加順序應(yīng)按照軟件設(shè)定模板進(jìn)行，確保板位與樣本對應(yīng)

• 樣品編號應(yīng)統(tǒng)一命名，便于后續(xù)分析追蹤

• 若實(shí)驗(yàn)涉及多個(gè)通道檢測，確保熒光染料無交叉干擾

五、操作流程

1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

• 打開軟件，點(diǎn)擊“新建實(shí)驗(yàn)"

• 選擇實(shí)驗(yàn)類型（定量PCR、熔解曲線分析、相對定量等）

• 選擇熒光染料和檢測通道，匹配實(shí)驗(yàn)方案

• 設(shè)定PCR擴(kuò)增程序，如：

• 95℃ 15秒

• 60℃ 60秒（熒光采集）

• 初始變性：95℃ 10分鐘

• 擴(kuò)增循環(huán)（40 cycles）：

• 設(shè)定板圖：將樣本、陰性對照、陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)注至對應(yīng)孔位

• 保存方法模板文件，便于重復(fù)使用

2. 加載樣品與運(yùn)行

• 打開儀器樣品艙，將96孔PCR板平穩(wěn)放置在加熱模塊上

• 關(guān)閉樣品艙蓋，確保均勻受熱

• 點(diǎn)擊“開始運(yùn)行"按鈕，系統(tǒng)將執(zhí)行程序并實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)

• 實(shí)驗(yàn)過程中可查看擴(kuò)增曲線，監(jiān)測熒光信號變化

3. 實(shí)驗(yàn)完成與數(shù)據(jù)分析

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)生成Ct值表格和擴(kuò)增圖

• 可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析、基因表達(dá)比值計(jì)算、熔解曲線分析等

• 可導(dǎo)出數(shù)據(jù)報(bào)告，包括Ct值、擴(kuò)增效率、圖表等格式

• 根據(jù)需求保存為PDF、Excel或圖像文件，進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的處理

• 移除PCR板并按廢物處理流程處置

• 用干凈棉簽或無塵紙巾清潔加熱模塊表面

• 關(guān)閉軟件與主機(jī)，切斷電源，蓋好防塵罩

• 核查實(shí)驗(yàn)記錄，補(bǔ)充試劑使用情況與樣本處理信息

六、注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)期間盡量避免樣品艙打開，防止溫控系統(tǒng)紊亂

2. PCR板應(yīng)均勻加樣，避免氣泡產(chǎn)生或液體溢出

3. 使用專用熒光染料，勿自行替換未驗(yàn)證的染料

4. 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)佩戴防護(hù)手套，避免污染反應(yīng)體系

5. 所有樣本及耗材使用后應(yīng)規(guī)范處置，防止污染環(huán)境

6. 每次使用前應(yīng)檢查儀器狀態(tài)，出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系維修人員

7. 盡量使用模板文件，提高操作一致性與數(shù)據(jù)可比性

七、常見問題與處理

八、維護(hù)與校準(zhǔn)

1. 日常維護(hù)

• 每次使用后進(jìn)行外觀清潔

• 保持儀器通風(fēng)口暢通，防止過熱

• 檢查電源線、USB或網(wǎng)絡(luò)連接狀態(tài)

2. 定期校準(zhǔn)

• 光學(xué)系統(tǒng)與溫控模塊應(yīng)根據(jù)廠商推薦周期進(jìn)行校準(zhǔn)

• 可使用賽默飛提供的校準(zhǔn)板進(jìn)行自檢

• 校準(zhǔn)應(yīng)由具備資格的人員或廠家技術(shù)支持人員執(zhí)行

• 記錄每次校準(zhǔn)與維護(hù)結(jié)果，備查

九、安全與應(yīng)急處理

• 實(shí)驗(yàn)操作遵守生物安全規(guī)定，使用生物安全柜處理高風(fēng)險(xiǎn)樣本

• 熒光染料避免直接接觸皮膚和眼睛

• 如遇試劑泄漏，立即使用70%乙醇或漂白劑進(jìn)行清理

• 設(shè)備發(fā)生電氣故障時(shí)，立即斷電并通知相關(guān)技術(shù)人員處理

• 實(shí)驗(yàn)過程中如發(fā)現(xiàn)異常升溫或煙霧，應(yīng)立即停止運(yùn)行并檢查電源系統(tǒng)

十、附錄：推薦PCR反應(yīng)體系（以20 μL為例）